高速臺(tái)式離心機(jī)分離血清脂蛋白技術(shù)
血清脂蛋白是由血液中脂質(zhì)與某些特異的蛋白質(zhì)組成的一類不均一的復(fù)合物。因其所含脂與載脂蛋白的比例不同，其密度范圍在0.96g/ml
或更低至1.21g/ml之間。紙電泳中顯示四條帶即：乳密顆粒，極低密度脂蛋白，低密度脂蛋白，高密度脂蛋白。每種脂蛋白還可以分為更多的亞組分。
用電泳法分離含載脂蛋白較高的組份(HDL，VHDL)比較成功，而離心分離法則適合用于各種密度的血清脂蛋白分離。
一．梯度材料：血清脂蛋白密度較低，常用的梯度材料為Nacl,NaI,Kbr,KI等，常用的緩沖劑為ED。
二．預(yù)分離：
1. 血細(xì)胞與血清分離：
離心參數(shù)：全血，角轉(zhuǎn)頭，3，000rpm×20min
結(jié)果：沉淀為血細(xì)胞，上部為血清。
2. 乳糜粒分離：禁食12小時(shí)以上人血漿中乳糜粒含量極少，已進(jìn)食者因其血漿含乳糜粒高，應(yīng)先離心去除乳糜粒。
離心參數(shù)：4 ×10 (g×min),10°C.各種轉(zhuǎn)頭轉(zhuǎn)速均可。
梯度液配置：離心管下部3/4容積加血漿，上部1/4容積加0。5MnaCl+0.3MEDTA,ph7.4
結(jié)果：乳糜粒上浮，吸出。
3. 血清蛋白分離：除去球蛋白，白蛋白及其它蛋白質(zhì)。
離心參數(shù)：(2。5-3)×10 (g× hr), 各種轉(zhuǎn)頭均可。如角轉(zhuǎn)頭70，000rpm×6hrs,10°C
配置：管容量1/3為血清，2/3為1。31g/ml,NaCl+NaBr,攪拌后終密度為1。21g/ml
結(jié)果：管上部1/6容積為血清脂蛋白，下部5/6為其它蛋白。
三． 方法：
1． 順序浮選法：
a) 超速法：最早使用的方法，4000rpm×24hrs×3次，10°CNaCl+NaBr梯度按1。006，1。063，1。21順序浮選，每次在管上部取出不同密度之
脂蛋白。操作簡單，分辨率高，得率高，費(fèi)時(shí)，成本高。
b) 超高速法：100，000rpm×2.5hrs×2次，10°C, 100，000rpm×4hrs×1次，NaCl+KBr+EDTA梯度按不含密度浮選出VLDL ，LDL，HDL
2． 單次離心法：
a) 單次水平分離
用最高轉(zhuǎn)速為25，000~28，000 rpm,6×40ml甩平轉(zhuǎn)頭以1.006g/ml NaCl液及1。35g/ml(NaCl+KBr+EDTA)液配置成從 1。006至1。21的8層不
連續(xù)階梯度，最下部用血清與KBr配成1。25g/ml樣品液，25，000rpm×4hrs,4oC一次得到VLDL，LDL，HDL不同層區(qū)帶。
用最高轉(zhuǎn)速為40，000 rpm ，6×13ml甩平轉(zhuǎn)頭，40，000 rpm×24hrs，20°C，不連續(xù)KBr梯度1.006~1.21g/ml,細(xì)長管，分層清晰，回收率
高，離心時(shí)間長
b) 單次垂直管分離：
NaCl/KBr或NaCl/NaBr不連續(xù)梯度單管容量從5ml到40ml，轉(zhuǎn)速從50，000 rpm~80，000 rpm，離心(0。5-3)hrs,下層用KBr或(NaBr)將血清調(diào)至1
。3g/ml上層用1.006g/ml,NaCl液，10°C-20°C，增加，減速一次分出。 NaCl/Sucrose不連續(xù)梯度下層為48%W/W Sucrose,中層血清在4MnaCl
中，上層為0。67M NaCl+0.05% EDTA,離心參數(shù)同上，時(shí)間較長。
c) 區(qū)帶轉(zhuǎn)頭大容量分離：
離心參數(shù)：區(qū)帶轉(zhuǎn)頭，最高轉(zhuǎn)速30，000~48，000rpm, 容量從650ml~1900ml,每次可分離血清50-150ml,低速加樣及卸載，分離轉(zhuǎn)速：大轉(zhuǎn)頭
(25,000-28,000rpm)×24hrs，小轉(zhuǎn)頭(30,000-38,000rpm)×1hrs，10°C-20°C
梯度液：NaCl+NaBr或KBr+EDTA不連續(xù)或線性梯度，樣品在最大密度層，近轉(zhuǎn)頭核心處用純水做隔離層，分離室最外部用高密度NaCl/KBr或
NaCl/NaBr作緩沖層。
收集：泵出后依此經(jīng)帶流動(dòng)地的紫外檢測(cè)儀檢測(cè)，自動(dòng)部分收集器收集。
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