免疫沉淀沒(méi)有它無(wú)法實(shí)現(xiàn)
今天要來(lái)講講離心機(jī)在免疫沉淀方面得重要性。
據(jù)了解染色質(zhì)免疫沉淀簡(jiǎn)稱ChIP用來(lái)研究DNA上的特定蛋白質(zhì)。
而RNA免疫沉淀法(RIP)和ChIP相近，但RNA免疫沉淀法是用來(lái)研究會(huì)與RNA結(jié)合的蛋白質(zhì)（RNA Binding ProteinImmunoprecipitation，RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀），是研究細(xì)胞內(nèi)RNA與蛋白結(jié)合情況的技術(shù)，利用針對(duì)目標(biāo)蛋白的抗體把相應(yīng)的RNA-蛋白復(fù)合物沉淀下來(lái)，通過(guò)離心機(jī)分離純化，對(duì)結(jié)合在復(fù)合物上的RNA 進(jìn)行RT-PCR驗(yàn)證或測(cè)序分析，了解轉(zhuǎn)錄后調(diào)控網(wǎng)絡(luò)動(dòng)態(tài)過(guò)程，是研究轉(zhuǎn)錄后調(diào)控網(wǎng)絡(luò)動(dòng)態(tài)過(guò)程的有力工具，能幫助我們發(fā)現(xiàn)miRNA的調(diào)節(jié)靶點(diǎn)。
RIP這種新興的技術(shù)運(yùn)用針對(duì)目標(biāo)蛋白的抗體把相應(yīng)的RNA-蛋白復(fù)合物沉淀下來(lái)，然后經(jīng)過(guò)分離純化就可以對(duì)結(jié)合在復(fù)合物上的RNA進(jìn)行分析。RIP可以看成是普遍使用的染色質(zhì)免疫沉淀ChIP技術(shù)的類似應(yīng)用，但由于研究對(duì)象是RNA-蛋白復(fù)合物而不是DNA-蛋白復(fù)合物，RIP實(shí)驗(yàn)的優(yōu)化條件與ChIP實(shí)驗(yàn)不太相同（如復(fù)合物不需要固定，RIP反應(yīng)體系中的試劑和抗體絕對(duì)不能含有RNA酶，抗體需經(jīng)RIP實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證等等）。
RIP技術(shù)下游結(jié)合microarray技術(shù)被稱為RIP-Chip，幫助我們更高通量地了解癌癥以及其它疾病整體水平的RNA變化，結(jié)合的RNA序列通過(guò)microarray（RIP-Chip），定量RT-PCR或高通量測(cè)序（RIP-Seq）方法來(lái)鑒定。
免疫沉淀是利用抗體特異性反應(yīng)純化富集目的蛋白的一種方法?？贵w與細(xì)胞裂解液或表達(dá)上清中相應(yīng)的蛋白結(jié)合后，再與蛋白A/G(ProteinA/G)或二抗偶聯(lián)的agarose或Sepharose珠子孵育，通過(guò)離心得到珠子-蛋白A/G或二抗-抗體-目的蛋白復(fù)合物，沉淀經(jīng)過(guò)洗滌后，重懸于電泳上樣緩沖液，煮沸5-10min，在高溫及還原劑的作用下，抗原與抗體解離，通過(guò)離心機(jī)離心收集上清，上清中包括抗體、目的蛋白和少量的雜蛋白。
免疫共沉淀是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法，是確定兩種蛋白質(zhì)在完整細(xì)胞內(nèi)生理性相互作用的有效方法。
免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)大致流程為:收集蛋白樣品—誘餌蛋白抗體沉淀誘餌蛋白—SDS-PAGE 分離蛋白—WB 檢測(cè)是否存在靶蛋白。
操作步驟
1.一般起步使用2個(gè)10cm2皿，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞三次，最后一次吸干PBS；
2.加入細(xì)胞裂解液（western及IP裂解液）裂解細(xì)胞，使蛋白終濃度在1-7mg/ml；
3.4°離心10min，去除細(xì)胞碎片；注意這里需要用到冷凍離心機(jī)，因?yàn)闇囟壬嫌袊?yán)格要求。
4.根據(jù)樣品量加入0.5-2ug左右抗體，4℃，旋轉(zhuǎn)過(guò)夜。
5.取10-30ul protein A/G 的beads于EP管中，棄上清，使用PBS洗滌beads一次。
6.將樣品加入EP管，4度垂直混勻2-3h。（在吸取瓊脂糖珠的時(shí)候，注意要搖勻管子，讓珠子和溶液混合均勻，同時(shí)黃槍頭要減掉頭子再吸取，以免破壞珠子），PBS洗脫；4度離心，棄上清，
7.洗脫三次，酌情用PBS/PBST/高鹽溶液洗瓊脂糖珠，最后一次吸干洗滌液。
8.將適量相應(yīng)抗體的多肽或0.1M PH2.8的甘氨酸稀釋到細(xì)胞裂解液中，混勻，取適量于beads中進(jìn)行洗脫,去除輕重鏈。若用甘氨酸HCL，樣品需要用NaOH中和，根據(jù)C1V1=C2V2計(jì)算加入NaOH的含量。
9.通過(guò)離心機(jī)離心取上清，制樣，跑膠。
以上就是關(guān)于離心機(jī)在免疫沉淀方面得講解，現(xiàn)在您知道“免疫沉淀沒(méi)有它無(wú)法實(shí)現(xiàn)”中得"它"說(shuō)的是什么了吧！
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