高速冷凍離心機(jī)提取細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的方法
發(fā)布時(shí)間：2015-5-12 16:35:54??????點(diǎn)擊：
1、Trixon-100或NP-40裂解液裂解；
2、凍融裂解法；
3、研磨法；
“經(jīng)典的就是分子克隆2講的,用RIPA裂解,然后刮下來(lái),冰裕30min,超生,4度離心10min”
（1） 單層貼壁細(xì)胞總蛋白的提?。?
1、倒掉培養(yǎng)液,并將瓶倒扣在吸水紙上使吸水紙吸干培養(yǎng)液（或?qū)⑵恐绷⒎胖靡粫?huì)兒使殘余培養(yǎng)液流到瓶底然后再用移液器將其吸走）.
2、每瓶細(xì)胞加3ml 4℃預(yù)冷的PBS（0.01M pH7.2～7.3）.平放輕輕搖動(dòng)1min洗滌細(xì)胞,然后棄去洗液.重復(fù)以上操作兩次,共洗細(xì)胞三次以洗去培養(yǎng)液.將PBS棄凈后把培養(yǎng)瓶置于冰上.
3、按1ml裂解液加10 μl PMSF（100mM）,搖勻置于冰上.（PMSF要搖勻至無(wú)結(jié)晶時(shí)才可與裂解液混合.）
4、每瓶細(xì)胞加400 μ含PMSF的裂解液,于冰上裂解30min,為使細(xì)胞充分裂解培養(yǎng)瓶要經(jīng)常來(lái)回?fù)u動(dòng).
5、裂解完后,用干凈的刮棒將細(xì)胞刮于培養(yǎng)瓶的一側(cè)（動(dòng)作要快）,然后用槍將細(xì)胞碎片和裂解液移至1.5ml離心管中.（整個(gè)操作盡量在冰上進(jìn)行.）
6、于4℃下12000rpm離心5min.（提前開(kāi)離心機(jī)預(yù)冷）
7、將離心后的上清分裝轉(zhuǎn)移倒0.5min的離心管中放于－20℃保存.
（2） 組織中總蛋白的提?。?
1、將少量組織塊置于1～2ml勻漿器中球狀部位,用干凈的剪刀將組織塊盡量剪碎.
2、加400 μl單去污劑裂解液裂（含PMSF）于勻漿器中,進(jìn)行勻漿.然后置于冰上.
3、幾分鐘后再碾一會(huì)兒再置于冰上,要重復(fù)碾幾次使組織盡量碾碎.
4、裂解30 min后,即可用移液器將裂解液移至1.5ml離心管中,然后在高速冷凍離心機(jī)4℃下12000rpm離心5min,取上清分裝于0.5ml離心管中并置于－20℃保存.
（3） 加藥物處理的貼壁細(xì)胞總蛋白的提取：
由于受藥物的影響,一些細(xì)胞脫落下來(lái),所以除按（一）操作外還應(yīng)收集培養(yǎng)液中的細(xì)胞.以下是培養(yǎng)液中細(xì)胞總蛋白的提?。?
1、將培養(yǎng)液倒至15ml離心管中,于2500rpm離心5min.
2、棄上清,加入4ml PBS并用槍輕輕吹打洗滌,然后2500rpm離心5min.棄上清后用PBS重復(fù)洗滌一次.
3、用槍洗干上清后,加100 μl裂解液（含PMSF）冰上裂解30min,裂解過(guò)程中要經(jīng)常彈一彈以使細(xì)胞充分裂解.
4、將裂解液與培養(yǎng)瓶中裂解液混在一起4℃、12000rpm離心5min,取上清分裝于0.5ml離心管中并置于－20℃保存.
（二）蛋白含量的測(cè)定
（1） 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)
1、從－20℃取出1mg/ml BSA,室溫融化后,備用.
2、取18個(gè)1.5ml離心管,3個(gè)一組,分別標(biāo)記為0μg,2.5μg,5.0μg ,10.0μg ,20.0μg ,40.0μg.
3、按下表在各管中加入各種試劑.
0μg 2.5μg 5.0μg 10.0μg 20.0μg 40.0μg
1mg/ml BSA － 2.5μl 5.0μl 10.0μl 20.0μl 40.0μl
0.15mol/L NaCl 100μl 97.5μl 95.0μl 90.0μl 80.0μl 60.0μl
4、混勻后,室溫放置2min.在生物分光光度計(jì)（Bio－Photometer,Eppentoff）上比色分析.
（2） 檢測(cè)樣品蛋白含量
1、取足量的1.5ml離心管,每管加入4℃儲(chǔ)存的考馬斯亮藍(lán)溶液1ml.室溫放置30min后即可用于測(cè)蛋白.
、取一管考馬斯亮藍(lán)加0.15mol/L NaCl溶液100 μl,混勻放置2分鐘可做為空白樣品,將空白倒入比色杯中在做好標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的程序下按blank測(cè)空白樣品.
3、棄空白樣品,用無(wú)水乙醇清洗比色杯2次（每次0.5ml）,再用無(wú)菌水洗一次.
取一管考馬斯亮藍(lán)加95 μl 0.15mol/L NaCl NaCl溶液和5μl待測(cè)蛋白樣品,混勻后靜置2min,倒入扣干的比色杯中按sample鍵測(cè)樣品.
注意：每測(cè)一個(gè)樣品都要將比色杯用無(wú)水乙醇洗2次,無(wú)菌水洗一次.可同時(shí)混合好多個(gè)樣品再一起測(cè),這樣對(duì)測(cè)定大量的蛋白樣品可節(jié)省很多時(shí)間.測(cè)得的結(jié)果是5 μl樣品含的蛋白量.
（三） SDS－PAGE電泳
（1） 清洗玻璃板：
一只手扣緊玻璃板,另一只手蘸點(diǎn)洗衣粉輕輕擦洗.兩面都擦洗過(guò)后用自來(lái)水沖,再用蒸餾水沖洗干凈后立在筐里晾干.
（2） 灌膠與上樣
1、玻璃板對(duì)齊后放入夾中卡緊.然后垂直卡在架子上準(zhǔn)備灌膠.（操作時(shí)要使兩玻璃對(duì)齊,以免漏膠.）
2、配分離膠,加入TEMED后立即搖勻即可灌膠.灌膠時(shí),可用10ml槍吸取5ml膠沿玻璃放出,待膠面升到綠帶中間線(xiàn)高度時(shí)即可.然后膠上加一層水,液封后的膠凝的更快.（灌膠時(shí)開(kāi)始可快一些,膠面快到所需高度時(shí)要放慢速度.操作時(shí)膠一定要沿玻璃板流下,這樣膠中才不會(huì)有氣泡.加水液封時(shí)要很慢,否則膠會(huì)被沖變型.） " S9 O. L+ `- T: E
3、當(dāng)水和膠之間有一條折射線(xiàn)時(shí),說(shuō)明膠已凝了.再等3min使膠充分凝固就可倒去膠上層水并用吸水紙將水吸干.
4、配5％的濃縮膠,加入TEMED后立即搖勻即可灌膠.將剩余空間灌滿(mǎn)濃縮膠然后將梳子插入濃縮膠中.灌膠時(shí)也要使膠沿玻璃板流下以免膠中有氣泡產(chǎn)生.插梳子時(shí)要使梳子保持水平.由于膠凝固時(shí)體積會(huì)收縮減小,從而使加樣孔的上樣體積減小,所以在濃縮膠凝固的過(guò)程中要經(jīng)常在兩邊補(bǔ)膠.待到濃縮膠凝固后,兩手分別捏住梳子的兩邊豎直向上輕輕將其拔出.
5、用水沖洗一下濃縮膠,將其放入電泳槽中.（小玻璃板面向內(nèi),大玻璃板面向外.若只跑一塊膠,那槽另一邊要墊一塊塑料板且有字的一面面向外.）
測(cè)完蛋白含量后,計(jì)算含50μg蛋白的溶液體積即為上樣量.取出上樣樣品至0.5ml離心管中,加入5×SDS 上樣緩沖液至終濃度為1×.（上樣總體積一般不超過(guò)20μl,加樣孔的最大限度可加25μl樣品.）上樣前要將樣品于沸水中煮5min使蛋白變性.
7、加足夠的電泳液后開(kāi)始準(zhǔn)備上樣.（電泳液至少要漫過(guò)內(nèi)測(cè)的小玻璃板.）用微量進(jìn)樣器貼壁吸取樣品,將樣品吸出不要吸進(jìn)氣泡.將加樣器針頭插至加樣孔中緩慢加入樣品.（加樣太快可使樣品沖出加樣孔,若有氣泡也可能使樣品溢出.加入下一個(gè)樣品時(shí),進(jìn)樣器需在外槽電泳緩沖液中洗滌3次,以免交叉污染.
（3） 電泳 電泳時(shí)間一般1-2 h,電壓為80較好,也可用100.電泳至溴酚蘭剛跑出即可終止電泳,進(jìn)行轉(zhuǎn)膜.
（四）轉(zhuǎn)膜
（1） 轉(zhuǎn)一張膜需準(zhǔn)備6張7.0～8.3cm的濾紙和1張7.3～8.6cm的硝酸纖維素膜.切濾紙和膜時(shí)一定要戴手套,因?yàn)槭稚系牡鞍讜?huì)污染膜.將切好的硝酸纖維素膜置于水上浸2 h才可使用.（用鑷子捏住膜的一邊輕輕置于有超純水的平皿里,要使膜浮于水上,只有下層才與水接觸.這樣由于毛細(xì)管作用可使整個(gè)膜浸濕.若膜沉入水里,膜與水之間形成一層空氣膜,這樣會(huì)阻止膜吸水.
（2） 在加有轉(zhuǎn)移液的搪瓷盤(pán)里放入轉(zhuǎn)膜用的夾子、兩塊海綿墊、一支玻棒、濾紙和浸過(guò)的膜.
（3） 將夾子打開(kāi)使黑的一面保持水平.在上面墊一張海綿墊,用玻棒來(lái)回?fù){幾遍以搟走里面的氣泡.（一手搟另一手要壓住墊子使其不能隨便移動(dòng).）在墊子上墊三層濾紙（可三張紙先疊在一起在墊于墊子上）,一手固定濾紙一手用玻棒搟去其中的氣泡.
（4） 要先將玻璃板撬掉才可剝膠,撬的時(shí)候動(dòng)作要輕,要在兩個(gè)邊上輕輕的反復(fù)撬.撬一會(huì)兒玻璃板便開(kāi)始松動(dòng),直到撬去玻板.（撬時(shí)一定要小心,玻板很易裂.）除去小玻璃板后,將濃縮膠輕輕刮去（濃縮膠影響操作）,要避免把分離膠刮破.小心剝下分離膠蓋于濾紙上,用手調(diào)整使其與濾紙對(duì)齊,輕輕用玻棒搟去氣泡.將膜蓋于膠上,要蓋滿(mǎn)整個(gè)膠（膜蓋下后不可再移動(dòng)）并除氣泡.在膜上蓋3張濾紙并除去氣泡.最后蓋上另一個(gè)海綿墊,搟幾下就可合起夾子.整個(gè)操作在轉(zhuǎn)移液中進(jìn)行,要不斷的搟去氣泡.膜兩邊的濾紙不能相互接觸,接觸后會(huì)發(fā)生短路.（轉(zhuǎn)移液含甲醇,操作時(shí)要戴手套,實(shí)驗(yàn)室要開(kāi)門(mén)以使空氣流通.）
將夾子放入轉(zhuǎn)移槽槽中,要使夾的黑面對(duì)槽的黑面,夾的白面對(duì)槽的紅面.電轉(zhuǎn)移時(shí)會(huì)產(chǎn)熱,在槽的一邊放一塊冰來(lái)降溫.一般用60轉(zhuǎn)移2 h或40轉(zhuǎn)移3 h. （6） 轉(zhuǎn)完后將膜用1×麗春紅染液染5min（于脫色搖床上搖）.然后用水沖洗掉沒(méi)染上的染液就可看到膜上的蛋白.將膜晾干備用. / h3 P" o9 d8 n% U8 X. R
（五）免疫反應(yīng)
（1） 將膜用TBS從下向上浸濕后,移至含有封閉液的平皿中,室溫下脫色搖床上搖動(dòng)封閉1h.
（2） 將一抗用TBST稀釋至適當(dāng)濃度（在1.5ml離心管中）；撕下適當(dāng)大小的一塊兒保鮮膜鋪于實(shí)驗(yàn)臺(tái)面上,四角用水浸濕以使保鮮膜保持平整；將抗體溶液加到保鮮膜上；從封閉液中取出膜,用濾紙吸去殘留液后,將膜蛋白面朝下放于抗體液面上,掀動(dòng)膜四角以趕出殘留氣泡；室溫下孵育1～2h后,用TBST在室溫下脫色搖床上洗兩次,每次10min；再用TBS洗一次,10min. （3） 同上方法準(zhǔn)備二抗稀釋液并與膜接觸,室溫下孵育1～2h后,用TBST在室溫下脫色搖床上洗兩次,每次10min；再用TBS洗一次,10min,進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng).
（六）化學(xué)發(fā)光,顯影,定影
將A和B兩種試劑在保鮮膜上等體積混合；1min后,將膜蛋白面朝下與此混合液充分接觸；1min后,將膜移至另一保鮮膜上,去盡殘液,包好,放入X-光片夾中.
在暗室中,將1×顯影液和定影液分別到入塑料盤(pán)中；在紅燈下取出X－光片,用切紙刀剪裁適當(dāng)大?。ū饶さ拈L(zhǎng)和寬均需大1cm）；打開(kāi)X-光片夾,把X－光片放在膜上,一旦放上,便不能移動(dòng),關(guān)上X-光片夾,開(kāi)始計(jì)時(shí)；根據(jù)信號(hào)的強(qiáng)弱適當(dāng)調(diào)整曝光時(shí)間,一般為1min或5min,也可選擇不同時(shí)間多次壓片,以達(dá)理想效果；曝光完成后,打開(kāi)X-光片夾,取出X-光片,迅速浸入顯影液中顯影,待出現(xiàn)明顯條帶后,即刻終止顯影.顯影時(shí)間一般為1～2min（20～25℃）,溫度過(guò)低時(shí)（低于16℃）需適當(dāng)延長(zhǎng)顯影時(shí)間；顯影結(jié)束后,馬上把X-光片浸入定影液中,定影時(shí)間一般為5～10min,以膠片透明為止；用自來(lái)水沖去殘留的定影液后,室溫下晾干.
應(yīng)注意的是：顯影和定影需移動(dòng)膠片時(shí),盡量拿膠片一角,手指甲不要?jiǎng)潅z片,否則會(huì)對(duì)結(jié)果產(chǎn)生影響.
凝膠圖象分析 將膠片進(jìn)行掃描或拍照,用凝膠圖象處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的分子量和凈光密度值.
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